Περιεχόμενο
Τα πηκτώματα αγαρόζης παρασκευάζονται από επιστήμονες που εργάζονται σε εργαστήρια μοριακής βιολογίας για τη μελέτη θραυσμάτων DNA που τροποποιούνται κατά τη διάρκεια της πειραματικής εργασίας. Η τεχνική κατασκευής πηκτής αγαρόζης είναι μια βασική δεξιότητα ρουτίνας που πρέπει να κυριαρχεί από όλους τους ερευνητές καθώς επιτρέπει την άμεση απεικόνιση διαφόρων μεγεθών DNA για επαλήθευση και γονιδιακή κλωνοποίηση έργων. Αν και η παρασκευή γέλης δεν είναι δύσκολη, όπως συμβαίνει με όλες τις εργαστηριακές διαδικασίες, θα πρέπει να δοκιμάζεται μόνο από έναν επαγγελματία ο οποίος έχει εκπαιδευτεί επιστημονικά λόγω των βιολογικών κινδύνων.
Οδηγίες
-
Βεβαιωθείτε ότι οι βάσεις γέλης δεν έχουν ρωγμές ή κάτι που θα μπορούσε να προκαλέσει διαρροή της θερμής αγαρόζης. Καθαρίστε τους δίσκους με 70% αλκοόλη και αφήστε να στεγνώσει εντελώς. Η βάση έχει δύο ανοικτά άκρα και δύο κλειστά άκρα. Σε μερικές μορφές, τα κλιπ τους παρέχονται για να κλείσουν τα άκρα, αλλά τα περισσότερα πρέπει να σφραγιστούν τοποθετώντας ταινίες μεταξύ των ανοιχτών τμημάτων. Πιέστε την ταινία σταθερά και σταθερά, καθώς μπορεί να απομακρυνθούν από τη θήκη και να επιτρέψουν τη διαρροή της θερμής αγαρόζης.
-
Με βάση το μέγεθος του θραύσματος DNA που πρόκειται να διαχωριστεί και αναλυθεί σε πήκτωμα αγαρόζης, προσδιορίστε το κατάλληλο ποσοστό που θα χρειαστεί. Για παράδειγμα, σε 1% (β / ο), το πήκτωμα αγαρόζης θα είναι αποτελεσματικό για την ανάλυση τμημάτων DNA 0,5 έως 10 kb. Όσο υψηλότερο είναι το ποσοστό (περισσότερη αγαρόζη), τόσο μικρότερο είναι τα θραύσματα που μπορούν να διαχωριστούν. Τα πειράματα ρουτίνας χρησιμοποιούν μια περιοχή από 0,5% έως 2% αγαρόζη. Για γέλη αγαρόζης 1%, ζυγίστε 1 g σκόνης αγαρόζης σε χημικό επίδεσμο ή σε άλλο σύστημα συγκράτησης. Μεταφέρετε προσεκτικά στην περιοχή παρασκευής εργαστηρίου του πηκτώματος.
-
Στην κατάλληλη περιοχή παρασκευής γέλης, μετρήστε 100 ml ρυθμιστικού διαλύματος ηλεκτροφόρησης. Θα πρέπει να είναι σε θερμοκρασία δωματίου. Μεταφέρετε τη σκόνη αγαρόζης σε φιάλη με πυράντοχο και ρίξτε τον μετρημένο όγκο ρυθμιστικού ηλεκτροφόρησης. Θερμαίνετε ελαφρά το μείγμα σε φούρνο μικροκυμάτων, αλλά μην το βράζετε, επειδή η εξάτμιση μπορεί να αλλάξει το ποσοστό της αγαρόζης που υπάρχει. Βεβαιωθείτε ότι διαλύεται όλη η αγαρόζη, ανακινείται για να αναμειχθεί καλά, αφήστε να κρυώσει ελαφρά και στη συνέχεια προσθέστε 0,5 μικρογραμμάρια ανά χιλιοστόλιτρο βρωμιούχου αιθιδίου. Μην αναπνέετε κανένα υδρατμό, καθώς αυτό μπορεί να ερεθίσει τους πνεύμονες και τους βλεννογόνους ιστούς. Επίσης, μην θερμαίνετε το διάλυμα μετά την προσθήκη του βρωμιούχου αιθιδίου. Ανακινήστε ξανά για να αναμίξετε και στη συνέχεια, ενώ η λύση είναι ακόμα αρκετά ζεστή για να χυθεί, διανείμετέ την στην προετοιμασμένη βάση. Σημειώστε ότι εάν υπάρχει ένας μεγάλος όγκος δείγματος ή μια μικρή συγκέντρωση DNA, μπορεί να γίνει μια παχύτερη γέλη. Ωστόσο, οι λεπτότερες πηκτές είναι ευκολότερο να αναλυθούν επειδή θα φωτογραφηθούν σαφέστερα.
-
Τοποθετήστε τις χτένες στη γέλη για να δημιουργήσετε αυλακώσεις ή φρεάτια για το δείγμα που πρόκειται να τοποθετηθεί. Αφήστε το να κρυώσει σε θερμοκρασία δωματίου για αρκετές ώρες ή στο ψυγείο για λίγα λεπτά. Στην τελευταία περίπτωση, μόλις η γέλη είναι έτοιμη, θα πρέπει να παρατηρηθεί η παρουσία κρυστάλλων αγαρόζης. Γενικά, εξαφανίζονται αν η γέλη αφεθεί να θερμανθεί σε θερμοκρασία δωματίου σε πάγκο για λίγα λεπτά πριν από τη χρήση. Αφαιρέστε προσεκτικά τις χτένες ώστε να μην σκιστεί το τζελ ή να σπάσετε τα φρεάτια. Η γέλη αγαρόζης είναι τώρα έτοιμη για χρήση. Αν δεν χρησιμοποιηθεί αμέσως, θα πρέπει να τυλιχτεί σε σελοφάν ή να αποθηκευτεί σε πλαστικό δοχείο στο ψυγείο για να αποφευχθεί η αποξήρανση ή η τήξη.
Παρασκευή της γέλης αγαρόζης
Ανακοίνωση
- Τα χρησιμοποιούμενα αντιδραστήρια είναι πιθανά καρκινογόνα και πρέπει να αντιμετωπίζονται με προσοχή και επαρκή προστασία. Σε περίπτωση που υπάρχει σφάλμα κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας του πηκτώματος, δεν πρέπει ποτέ να επαναθερμανθεί, αλλά να απομακρυνθεί και να παρασκευαστεί και πάλι νέα γέλη.
Τι χρειάζεστε
- Πούδρα αγαρόζης για ηλεκτροφόρηση
- Buffer ΤΑΕ ή ΤΒΕ
- Διάλυμα βρωμιούχου αιθιδίου
- Βάση γέλης
- Κλιπ ταινιών ή ταινιών βάσης
- Χτένες με γέλη
- Κλίμακες και αναλώσιμα
- Αιθανόλη
- Εργαστηριακά πετσέτες
- Προσωπικός προστατευτικός εξοπλισμός