Περιεχόμενο
Το Lise είναι μια ελληνική λέξη και σημαίνει απλά «διαχωρισμό» ή «αποσύνθεση». Είναι μια καλή περιγραφή της αντίδρασης που συμβαίνει με τα κύτταρα σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, μια λύση που τα διασπά για να εξαγάγει το περιεχόμενό τους. Οι επιστήμονες χρησιμοποιούν αυτές τις λύσεις για την εξαγωγή DNA ή πρωτεϊνών στην ανάλυση κυττάρων, ειδικά στην περίπτωση βακτηρίων. Ο τύπος του ρυθμιστικού λύσης κυττάρων ποικίλλει ανάλογα με τον τύπο του πειράματος, ωστόσο θα αναφέρουμε μερικές κοινές επιλογές.
Ρυθμιστικό και αλάτι
Τα ρυθμιστικά διαλύματα σταθεροποιούν το ρΗ, ενώ τα κύτταρα υφίστανται τη διαδικασία λύσης. Το διάλυμα tris-HCL είναι το πιο συνηθισμένο ρυθμιστικό για ρυθμιστικό διάλυμα σε ρΗ 8, εάν το ρΗ είναι επιθυμητό. Το HEPES είναι μια άλλη κοινή ρυθμιστική λύση σε αυτά τα πειράματα. Το χλωριούχο νάτριο μπορεί επίσης να προστεθεί για να αυξήσει την ιοντική ισχύ, τη συνολική συγκέντρωση διαλυτών εκτός των κυττάρων. Το τελευταίο είναι σημαντικό δεδομένου ότι το νερό μπορεί να εξαπλωθεί σε όλες τις κυτταρικές μεμβράνες, από περιοχές με χαμηλή συγκέντρωση διαλυμένης ουσίας έως εκείνες με υψηλή συγκέντρωση.
Απορρυπαντικό
Το απορρυπαντικό είναι το κύριο συστατικό που διαλύει την κυτταρική μεμβράνη έτσι ώστε το περιεχόμενο να διαφύγει. Τα απορρυπαντικά είναι αμφιπαθή μόρια, δηλαδή, με το ένα άκρο που αλληλεπιδρά εύκολα με μόρια νερού, ενώ το άλλο υδρόφοβο άκρο, ή «που φοβάται το νερό», δεν κάνει αυτήν την αλληλεπίδραση. Μπορούν να διαλύσουν τα λίπη σχηματίζοντας μικκύλια, μικρές ομάδες, στις οποίες οι υδρόφοβες ουρές των μορίων απορρυπαντικού οδηγούν προς τα μέσα στα μόρια λίπους. Τα κοινά απορρυπαντικά είναι δωδεκυλ θειικό νάτριο ή SDS, NP-40 και tritonX.
Χηλικοί παράγοντες και αναστολείς
Τα ρυθμιστικά διαλύματος λύσης συνήθως περιέχουν επίσης χηλικούς παράγοντες όπως αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (ΕϋΤΑ) ή τετραοξεικό οξύ ρετυλενογλυκόλης (EGTA). Αυτές οι χημικές ουσίες συνδέονται με μεταλλικά ιόντα με φορτίο +2 (για παράδειγμα, μαγνήσιο και ασβέστιο), καθιστώντας τα έτσι μη διαθέσιμα για άλλες αντιδράσεις. Πολλές DNAses (πρωτεΐνες που μασούν DNA) και πρωτεάσες (πρωτεΐνες που κόβουν άλλες πρωτεΐνες) χρειάζονται ιόντα μαγνησίου για να λειτουργήσουν, οπότε στερώντας τους από αυτό το κύριο συστατικό, EDTA και EGTA, βοηθούν στη μείωση του επιπέδου πρωτεάσης ή της δραστηριότητας DNAse. Ωστόσο, δεν τις αποκλείουν εντελώς, και ορισμένες πρωτεάσες δεν εξαρτώνται από συμπαράγοντες μαγνησίου, έτσι τα ρυθμιστικά διαλύματος λύσης μερικές φορές περιέχουν επίσης ουσίες που ονομάζονται αναστολείς πρωτεάσης, οι οποίες δεσμεύονται σε αυτήν και την εμποδίζουν να λειτουργεί σωστά.
Αλκαλική λύση
Η αλκαλική λύση είναι μια πολύ κοινή τεχνική για τον καθαρισμό πλασμιδίων από βακτήρια. Αυτή η μέθοδος συνεπάγεται τη χρήση τριών λύσεων. Το πρώτο περιέχει γλυκόζη, tris-HCL ρυθμιστικό, EDTA και RNAses. Η γλυκόζη δημιουργεί υψηλή συγκέντρωση διαλυμένης ουσίας εκτός βακτηρίων, έτσι ώστε να γίνονται ελαφρώς εύθραυστα, διευκολύνοντας τη διαδικασία λύσης. Το EDTA και το tris-HCL λειτουργούν όπως περιγράφηκε προηγουμένως, ενώ το RNAse θα μασήσει οποιοδήποτε RNA μέσα στο κελί για να το ξεφύγει. Η δεύτερη λύση κάνει αποτελεσματικά την κυτταρική λύση. Περιέχει το απορρυπαντικό SDS και NaOH, το οποίο αυξάνει το pH στο 12 ή παραπάνω, μετουσιώνει τις πρωτεΐνες μέσα στο κύτταρο και προκαλεί το DNA να διαχωριστεί σε απλά νημάτια. Το τρίτο διάλυμα περιέχει οξικό κάλιο για την αποκατάσταση του ρΗ σε πιο ουδέτερο επίπεδο, έτσι ώστε οι κλώνοι DNA του πλασμιδίου να μπορούν να ενώνονται. Εν τω μεταξύ, οι μετουσιωμένες πρωτεΐνες ενώνονται και καθιζάνουν, ενώ τα ιόντα δωδεκυλ θειικού ενώνονται με τα ιόντα καλίου για να σχηματίσουν μια αδιάλυτη ένωση, η οποία μπορεί επίσης να καθιζάνει εκτός διαλύματος.