Περιεχόμενο
Η ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης είναι μια επιστημονική διαδικασία που χρησιμοποιείται σε ερευνητικά και διαγνωστικά έργα που αφορούν τη μελέτη των νουκλεϊνικών οξέων. Επιτρέπει στον επιστήμονα ή τον τεχνικό να διαχωρίσει τα φορτισμένα μόρια νουκλεϊκού οξέος, όπως το DNA, ανάλογα με το μέγεθός τους και χρησιμοποιείται για την ανάλυση των προϊόντων που παράγονται από το πείραμα, όπως η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης. Χρησιμοποιείται συστηματικά επειδή είναι ανέξοδο να τρέχει, να επεξεργάζεται γρήγορα και να επιτρέπει την ανάκτηση του προς ανάλυση νουκλεϊκού οξέος.
Κάνοντας το πήκτωμα
Συλλέξτε όλα τα απαραίτητα αντικείμενα και καθαρίστε τα με 70% αιθανόλη. Τα αντικείμενα περιλαμβάνουν δίσκο από χυτοσίδηρο, κολλητική ταινία, αγαρόζη εργαστηριακής ποιότητας, φιάλες ή κυλίνδρους, 10x συμπύκνωση (Tris-Borate-EDTA, TBE) ρυθμιστικό διάλυμα, βρωμιούχο αιθίδιο, χρωστική ουσία και δείγμα προς ανάλυση. Βεβαιωθείτε επίσης ότι έχετε μια δεξαμενή ηλεκτροφόρησης πηκτής και πηγή ενέργειας. Η αγαρόζη παρασκευάζεται με ζύγιση της κατάλληλης ποσότητας ταινίας DNA που πρόκειται να αναλυθεί, ανάμειξή της με το ρυθμιστικό διάλυμα ΤΒΕ και τήξη στο φούρνο μικροκυμάτων. Γενικά, ένα διάλυμα 1% έως 2% αρκεί για να καλύψει πολλές ίνες DNA που μελετώνται στην καθημερινή μοριακή βιολογία. Τα μικρά DNA απαιτούν πιο συμπυκνωμένα πηκτώματα, ενώ τα μεγαλύτερα απαιτούν πιο αραιωμένα πηκτώματα. Το διάλυμα αγαρόζης αναμιγνύεται με βρωμιούχο αιθίδιο, το οποίο θα δεσμεύεται με το νουκλεϊκό οξύ κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ηλεκτροφόρησης. Αυτό το διάλυμα χύνεται εντός του δίσκου τήγματος του πηκτώματος, ακριβώς όπως εισάγεται χτένα χύτευσης και το μίγμα αφήνεται να στερεοποιηθεί.
Τοποθετήστε και ενεργοποιήστε το τζελ
Το πήκτωμα αφαιρείται από το δίσκο και βυθίζεται σε δεξαμενή ηλεκτροφόρησης πηκτώματος που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα εκτέλεσης. Τα προς ανάλυση δείγματα αναμειγνύονται με χρωστικές και τοποθετούνται σε φρεάτια στο πήκτωμα που δημιουργείται από τη χτένα. Ένας δείκτης ή κλίμακα συμπεριλαμβάνεται επίσης για να επιτρέψει στον ερευνητή να δει την πρόοδο της ηλεκτροφόρησης και να προσδιορίσει το μέγεθος των παραγόμενων θραυσμάτων. Στη συνέχεια εφαρμόζεται ηλεκτρικό ρεύμα στο πήκτωμα, το οποίο αναγκάζει το δείγμα να μεταναστεύσει από το ένα άκρο της γέλης στο άλλο. Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, τα νουκλεϊνικά οξέα στο δείγμα χωρίζονται σε θραύσματα διαφορετικών μεγεθών, με μεγαλύτερα μόρια να πλησιάζουν στο φρεάτιο και μικρότερα μόρια που κινούνται προς το άλλο άκρο της γέλης.
Αναλύστε το πήκτωμα
Μετά την περάτωση της διαδικασίας ηλεκτροφόρησης, η γέλη απομακρύνεται από τη δεξαμενή και τοποθετείται σε ένα διαυγαστηριακό υπεριώδες, το οποίο φωτίζει τα θραύσματα νουκλεϊκού οξέος που δεσμεύονται με το φθορίζον βρωμιούχο αιθίδιο. Μια φωτογραφία αυτού γίνεται και οι ζώνες των νουκλεϊνικών οξέων μπορούν να μετρηθούν ανάλογα με την απόσταση που μετανάστευσε μέσω του πηκτώματος. Η κλίμακα θα τα διαχωρίσει σε ζώνες γνωστών μεγεθών και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να καθοδηγήσει τον ερευνητή κατά την ανάλυση.