Περιεχόμενο
Οι τεχνικές ηλεκτροφόρησης διαχωρίζουν μόρια DNA με βάση τα μεγέθη τους. παρόμοιες τεχνικές για τις πρωτεΐνες μπορούν να τις χωρίσουν με βάση το μέγεθος ή το φορτίο. Και στις δύο περιπτώσεις, η γέλη μέσω της οποίας μεταφέρονται τα μόρια παρασκευάζεται χρησιμοποιώντας ένα ρυθμιστικό διάλυμα, ένα χημικό που δρα για να σταθεροποιήσει το ρΗ. Το καπάκι εκπληρώνει πολλούς ζωτικούς ρόλους στην ηλεκτροφόρηση.
Τρέχουσα
Το πήκτωμα ηλεκτροφόρησης λειτουργεί με την εφαρμογή ενός ηλεκτρικού ρεύματος στη βυθισμένη πλάκα πηκτής στο ρυθμιστικό. Τα μόρια ϋΝΑ είναι αρνητικά φορτισμένα και οι πρωτεΐνες μπορούν να φορτωθούν αρνητικά με μετουσίωση πρώτα και στη συνέχεια με επεξεργασία με δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS). Οι πρωτεΐνες ή τα μόρια ϋΝΑ μεταναστεύουν από την αρνητικά φορτισμένη κάθοδο στην θετικά φορτισμένη άνοδο. Το νερό, ωστόσο, είναι ένα μάλλον φτωχό όχημα στο ρεύμα - μεταφέρει μόνο ρεύμα όταν διαλύει ουσίες σε αυτό, καθώς τα φορτισμένα ιόντα κινούνται σε ένα ηλεκτρικό πεδίο. Το ρυθμιστικό διάλυμα έχει υψηλότερη συγκέντρωση ιόντων (υψηλότερη ιοντική ισχύ), έτσι ώστε να μπορεί να μεταφέρει πολύ περισσότερα ρεύματα από το καθαρό νερό.
Αλλαγή PH
Το ρΗ μετρά τη συγκέντρωση του ιόντος υδρογόνου. Η αλλαγή στο pH μπορεί να αλλάξει το καθαρό φορτίο των μορίων, όπως η πρωτεΐνη ή το DNA, προκαλώντας μια αργότερη (ή ταχύτερη) μετανάστευση. Αυτό συμβαίνει επειδή αυτά τα μόρια έχουν βασικά μέρη που δέχονται ιόντα υδρογόνου (πρωτόνια) και πολλά όξινα μέρη που μπορούν να δώσουν πρωτόνια. Όταν ένα οξύ δίνει ένα πρωτόνιο, γίνεται αρνητικά φορτισμένο. όταν μια βάση δέχεται ένα πρωτόνιο, αντίθετα, φορτίζεται θετικά. Καθώς η συγκέντρωση των ιόντων υδρογόνου στο διάλυμα αυξάνεται, οι πρωτεΐνες και το DNA γίνονται λιγότερο αρνητικά φορτισμένες (ή περισσότερο θετικά φορτισμένες). Το ρΗ στο οποίο ένα μόριο, όπως και η πρωτεΐνη, δεν έχει φορτίο ονομάζεται ισοηλεκτρικό σημείο. Ρυθμιστικά διαλύματα σταθεροποιούν το ρΗ στο πήκτωμα σε ένα επίπεδο όπου το ϋΝΑ θα φορτιστεί αρνητικά και θα μεταναστεύσει όπως είναι επιθυμητό.
Τζελ στοίβαξης
Τα ρυθμιστικά διαλύματα παίζουν έναν ακόμα πιο περίπλοκο ρόλο σε ένα είδος ηλεκτροφόρησης που ονομάζεται SDS-PAGE ή δωδεκυλοθειικό νάτριο, ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου. Αυτή είναι μια από τις πιο κοινές τεχνικές για την ανάλυση πρωτεϊνών. Μετουσιώνονται με θερμική κατεργασία και στη συνέχεια επικαλύπτονται με δωδεκυλοθειικό νάτριο και μόνο στη συνέχεια προστίθενται στο πήκτωμα, το οποίο γενικά εκτελεί κατακόρυφα. Το πήκτωμα έχει δύο περιοχές, εκείνη της στοίβαξης (στο ανώτερο τμήμα) και εκείνη που τρέχει από κάτω. Η γέλη στοίβαξης παρασκευάζεται με διαφορετικό ρυθμιστικό διάλυμα έτσι ώστε το ρΗ του να είναι χαμηλότερο από εκείνο της γέλης που τρέχει, επιπλέον, έχει μικρότερη ιοντική ισχύ. Αυτοί οι δύο παράγοντες προκαλούν τη στοίβαξη της πρωτεΐνης, έτσι πηγαίνει όλος στο τζελ λειτουργίας ταυτόχρονα. Αυτή η επίδραση βοηθά στην εξασφάλιση του διαχωρισμού των πρωτεϊνών στη γέλη ανάλογα με το μέγεθός τους.
Ηλεκτροφόρηση ΟΝΑ Cap
Τα δύο συνηθέστερα ρυθμιστικά διαλύματα για την ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα DNA είναι το τρις-οξικό ΕϋΤΑ και το τρις-βορικό ΕϋΤΑ, όπου το ΕϋΤΑ σημαίνει αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ. Είναι σημαντικό επειδή χρησιμεύει ως χηλικός παράγοντας για τα ιόντα μαγνησίου, τα αφαιρώντας από τη λύση. Αυτά τα ιόντα είναι βασικοί συμπαράγοντες για ένζυμα που ονομάζονται ϋΝΑ που διασπούν το DNA, έτσι ώστε το EDTA στο buffer λειτουργεί ως πρόσθετη προφύλαξη για την πρόληψη τυχόν προβλημάτων με τα DNA.